Am Nikolaustag im Dezember 1954 rollte der erste O 321 H aus dem Werk Mannheim, das kurz zuvor zum zentralen Omnibuswerk der damaligen Daimler-Benz AG erklärt worden war. Der neue Omnibus verfügte auch über ein neues technisches Konzept: Mit seiner Semi-Integralbauweise verabschiedete er sich von der bis gepflegten Chassisbauweise – das Ende der Gemeinsamkeiten von Omnibussen und Lastwagen war vollzogen – von den Antriebsaggregaten einmal abgesehen. Eingeläutet hatte diesen Schritt als Frontlenker mit Heckmotor bereits einige Jahre zuvor der Mercedes-Benz O 6600 H, sein Aufbau jedoch ruhte ganz nach herkömmlicher Art auf einem Leiterrahmenchassis.
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